大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。

常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。