甲氨蝶呤主要作为一种抗肿瘤药，主要作用于叶酸的途径。在叶酸的途径中，四氢叶酸在体内合成嘌呤核苷酸和嘧啶脱氧核苷酸，甲氨蝶呤作为叶酸还原酶抑制剂，主要抑制二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成受到阻碍，导致DNA的生物合成受到抑制，起到抗肿瘤的作用。甲氨蝶呤在临床上主要可以用于各种急性白血病，特别是急性淋巴细胞白血病，也可以用于恶性淋巴瘤，还可以用于多发性骨髓瘤。另外，也可以用于治疗乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌。总之，甲氨蝶呤是一种抗肿瘤药。